细胞基因治疗产品开发中的宿主细胞残留DNA片段污染风险评估之毛细管电泳分析法

为了实现细胞和基因疗法令人难以置信的潜力，必须克服许多挑战，确保它们符合严格的安全监管并安全地提供给患者。一个持续的挑战是残留的宿主细胞 DNA（residual host cell DNA, rHCD）污染，这种污染可能在整个研发和制造过程中的多个环节出现。
为了确保患者安全，美国食品药品监督管理局（FDA）发布了细胞和基因治疗制造的行业指南[1]。

“We recommend that you limit the amount of residual DNA for continuous non-tumorigenic cells to less than 10ng/dose and the DNA size to below approximately 200 base pairs. If you are using cells that are tumor-derived (e.g., HeLa) or have tumorigenic phenotypes (e.g., HEK293, HEK293T) or other characteristics that may give rise to special concerns, the limitation of specific residual DNA quantities may be needed to assure product safety … Your tests should be appropriately controlled and of sufficient sensitivity and specificity to determine the level of these sequences in your product.”

国家药品监督管理局药品审评中心(CDE)于 2022 年 5 月发布了《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》，明确指出“要对 DNA 残留量和残留片段的大小进行控制，建议尽量将残留 DNA 控制在 10 ng/剂内，DNA 残留片段的大小控制在 200bp 以内”。

为了确保遵守这些严格的指导方针，生物制药制造商需要更为先进的解决方案。上海测简奕和安捷伦科技前期已联合开发了 rHCD 片段大小分析方案（点击查看），该方案具有“分得开、测得准、通量高”的优势，可用来快速评估安全性风险并优化生产工艺流程。为了降低细胞基因治疗 (CGT) 产品的开发风险，我们建立了更具针对性的分析解决方案。

灵敏、准确的片段分布检测

针对法规中关于宿主细胞 DNA 检测灵敏度的要求，我们将 DNA 混合片段标准品（包含 75~700 bp 不同大小的 DNA 片段）分别稀释至总浓度 5 pg/µl、2 pg/µl，1 pg/µl和 500 fg/µl的样本，并通过片段分析电泳仪及配套试剂盒进行片段分离及含量分析（图 1）。不同浓度标品各片段相对含量检测值基本一致，相对标准偏差 RSD 为 2.39%~10.70%（表 1）。即浓度低至 500 fg/µl浓度下（其中 200bp 片段为 35 fg/µl），各片段信噪比均大于 10，且各片段相对含量检测准确度为 86%~99%（图 2）。说明片段分析仪灵敏度、准确度和精密度均能满足细胞基因治疗 (CGT) 产品中宿主细胞残留 DNA 片段大小分布的检测需求。
注：*为系统峰

图 1. 不同浓度片段标准品检测电泳图

表 1. 不同浓度*片段标准品片段相对含量的偏差

图 2. DNA 片段标准品（500 fg/µl）片段相对含量准确度

快速、准确的样品前处理

在上述实验基础上，我们加入宿主细胞残留 DNA 抽提流程（测简奕试剂盒），可在 3 小时内完成 11 个独立样品的核酸抽提及片段信号收集分析流程。以 5 pg/µl DNA（其中 200 bp 片段为 350 fg/µl）混合片段样品检测结果为例，经抽提试剂盒处理，各片段相对含量准确度为 81%~98%（图3，4）。该结果表明本分析方案回收率能满足宿主细胞 DNA 残留检测需求。
图 3. DNA 片段标准品（5pg/µl）检测电泳图
图 4. DNA 片段标准品（5 pg/µl）片段相对含量准确度

应用案例

接着，我们分析了一种细胞治疗样品中宿主残留 DNA 的片段大小分布。实验结果（图 5，表 2）显示该样本残留的宿主 DNA 片段均为安全风险等级较低的小片段（200 bp 以下）。


图 5. 一种细胞治疗样品中宿主残留 DNA 的片段大小分布

表 2. 一种细胞治疗样品中宿主残留 DNA 片段大小分布比例

参考文献

[1] FDA Guidance for Industry: Chemistry Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs), January 2020.

安捷伦片段分析仪介绍

安捷伦片段分析仪系统采用自动化并行毛细管电泳技术，可通过配合使用专属试剂盒定性和定量分析 DNA 或 RNA 样品，如质粒、基因组 DNA、总 RNA，小 RNA、CRISPR 编辑 RNA、大 DNA 片段等。毛细管阵列是片段分析仪系统的基础。填充凝胶后，首次进样施加电压，然后 DNA 或 RNA 样品根据其分子量大小通过各个毛细管实现分离。当片段通过检测窗口时，高灵敏度电荷耦合检测器 (CCD) 将采集片段的荧光信号，最后通过 ProSize 数据分析软件包自动计算片段大小以及定量分析结果。安捷伦提供的三种型号的片段分析仪系统（通量和自动化程度不同），可满足不同实验室的检测分析需求。